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NOとヘモグロビン分子の関係

NO(一酸化窒素)の活動のうち、血管調節は特に重要なポイントで、たとえばARDS へのNO吸入も肺血管拡張狙いで、吸収後は血液が処理して全身反応なしと考えられてきました。それにしても、NOは「局所でつくられてその場所に作用する」と理解していましたが、ふとしたきっかけでNOは局所で作られるだけでなくて、血液で運ばれて作用を発揮する道もあるらしいと知りました。そうすると、「吸入したNOは全身には作用しない」という当初の想定は単純すぎるようです。
今回の解説はテーマの関係上、従来と少し雰囲気が異なり通常の「解説」的な内容で、引用文献も通常のスタイルで付しましたが、実はほぼすべて全文がインターネットに公開されていわゆる「オープンアクセス」論文です。

Ⅰ. NOの血液中での移動の姿:2つの研究グループ
ところが、NOの濃度と溶解度と投与量をみると、水への溶解では運べません。NOの溶解度は、ブンゼン係数で74 mL/L(≒3mM/L)で、ARDSなどに投与する濃度である80ppmが全量血液に吸収されると計算上の濃度は240 nM程度となります。一方、血漿の遊離NO濃度は 3.4 nMと二桁低い値です。そうすると、NOは血漿に溶けて移動するのではなく、別の形で移動して局所でNOとなって放出されると考えざるを得ません。
この点で最近提案されているメカニズムが二つあり、二つの研究グループがそれぞれデータを提出して強力に主張しています。一つは「亜硝酸イオンとして運ばれる」という派であり、もう一つは「ヘモグロビンと結合して運ばれる」という派です。いずれも、血管作用部位でNOになって放出されるという点では一致しています。

Ⅱ. 基礎の化学の問題
二つのグループの研究を紹介する前に、基礎の化学を概観します。特に、ヘモグロビン派の主張の理解に必要です。
ヘモグロビンとNOが結合する様式にも実は二種あり、一つはNOがヘムと直接結合し、鉄ニトロシルヘモグロビンとなります。ある論文で「NOは分子としても酸素と類似している」と表現していましたが、その言い方をつかえば「鉄ニトロシルヘモグロビン」は「酸素ヘモグロビンの酸素の代わりにNOがついた」物質ということになります。。
もう一つは、β鎖の93番目のアミノ酸のシステイン、つまり"93Cysβ"と結合する反応です。ちなみに、すぐとなりの"92Hisβ"(β鎖の92番目のアミノ酸のヒスチジン)は、ヘムとの主結合点です。NOは、ヘムと93Cysβと92Hisβの間を行き来する、ないしは「一部はヘムに、一部はシステインに結合」と主張していますが、この説明がどの程度信用できるか不明です。
システインと結合すると、NOは電離して"-NO€lj"となり、これを「ニトロシル基」と呼び、できた物質を「s-ニトロソヘモグロビン」と名づけます。冒頭の"s-"はシステインのイオウ原子にNOがついている意味で、「ニトロソ」は"-NO"(電離していないもの)を指します。この物質を"SNOHb"ないし"HbSNO"という略号で表現する場合もあり、ここでは前者を採用します。
他に論文に登場する名前としては、「チオール」または「サイオール」があります。アルコールのOH のOの代わりにSが入って-SH を末端に持つ物質一般を指す用語で、システインはカルボキシル基の反対側に"SH-"をもつチオールで、ここにNOが入って"H-S-N(=O)-CH2-"という構造になったものを「ニトロソチオール」と呼びます。

Ⅲ. 内容を少し詳しく解説
Ⅲ-a. 二つのグループに共通した解析法
問題の「NOを何が運搬するか」ですが、両派とも濃度測定と大動脈環標本の灌流実験を使用しています。濃度測定は、動静脈血液でそれぞれお目当ての物質の濃度の比較して、取り込みあるいは産生量を評価し、もちろん条件を変えて実験します。大動脈環標本の灌流実験は、ウサギないしはラットの大動脈を切り出して環状の標本をつくりインビトロで灌流して、やはりお目当ての物質を投与して張力を測定します。この際に後に述べるように酸素環境が重要で、灌流液の酸素レベルも変化させて測定して、当該物質に「ハイポキシアの血管を拡張する作用があり」、「ハイポキシアでの血管拡張の本態はこれ」と主張する根拠にします。

Ⅲ-b. 亜硝酸イオン派
次に二つのグループの発表をいくつかずつ解説します。
亜硝酸イオン派が単純な印象なので、そちらを先に紹介します。グループの長であるGladwin が2000年に出した論文(Ref 1)は、それより数年前に提出されていたヘモグロビンへの反論を意識している内容で、まず血漿亜硝酸イオン濃度の動静脈血の較差を測定して、「血流はこの血漿亜硝酸イオンを用いてNOを供給して」おり、さらに「sニトロソサイオールは検出できず、s-ニトロソアルブミンレベルも従来の報告より2桁低く」、しかも「SNOHbには動静脈血較差はないから、この経路でのNO産生は微量」とし、結局「局所血流調節を行うのは亜硝酸イオン」と結論しています。次は、その翌年の2001年にボランティアにNOを80ppm 吸入させて末梢血流が増加することを証明し、この反応は局所でのNO生成を酵素的にブロックしても維持されるので血液を介する反応で、しかも「動脈血の亜硝酸イオンが増加し、亜硝酸イオンには動静脈較差がみられたが、SNOHb(s-ニトロソヘモグロビン)は量が極端に少なく、動静脈較差もなかった」と亜硝酸イオンの役割を強調し、SNOHbの役割を否定しています(Ref 2 Cannon)。三つ目は2006年の複雑な実験の発表で、「亜硝酸イオンを介するNO依存性の血管拡張は、ガス状NOの生成、cGMP産生、ミトコンドリア呼吸の抑制などで確認」し、特に「NOが血管拡張を起こす際に、酸素飽和度が50%まで下がると血管拡張が始まる点からみて、ヘモグロビンによる酸素感受能は亜硝酸イオン還元とリンクして、これが血管拡張を刺激」すると結論しています。(Ref 3 Crawford)

Ⅲ-c. ヘモグロビン派
今度は、ヘモグロビンとの結合を研究するグループの主張です。いろいろな事柄を述べて、まとめて「NOの作用にはヘモグロビンが重要な働き」と主張します。
「ヘモグロビンに亜硝酸イオンからs-ニトロソサイオールを合成する作用がある」という発表は、「ヘモグロビンがNOと結合すると血管収縮がおこって、酸素運搬が障害される」反応は Po2が高い領域で発生し、Po2が低い領域(5-20mmHg)では逆に血管拡張を招き、結果的に組織のPo2が低下すると血管拡張が起こって、酸素の需要と運搬をマッチさせると解釈します。NOとヘモグロビンが結合してSNOHb になると血管拡張能が維持しやすくなり、ヘモグロビンに酸素のない状態(T状態:Tはtense ) すなわち還元ヘモグロビンのニトロソ体はNOを放出しやすいとしています。
この際、Hb[Fe(III)NO] (鉄が三価:メトヘモグロビンにNOがついたもの)が重要な作用を果たし、酸素が加わるとNOの結合点はヘムから隣りのシステインに移動してSNOHb に転換し、メトヘモグロビンは2価鉄のヘモグロビンに戻ると説明しています(Ref 4, Angelo)。メトヘモグロビンまで動員する説明は面白いけれど、科学的な根拠は明確ではありません。
別に、s-ニトロソヘモグロビンと酸素の結合と血管作動性を検討した研究では、「ヘモグロビンが酸素を失ってT状態になるとNOを結合し、遊離のNOが極端に増して毒性を発揮するのを防止している」と説明します。β鎖93システインからNOが放出され、還元ヘモグロビンになるとこのNOを捉え、結局SNOHb と鉄ニトロシルヘモグロビンの間は、酸素を介する平衡がNOの安定を保つとしています。一応原著論文ですが、解説の雰囲気を漂わせています(Ref 5,McMahon)。
ヘモグロビンがNOと結合して、必要な部位で放出するというダイナミックな機序の解説としてはStamler と直接は関係なさそうなものが生理学雑誌にも載っています(Ref 6, Allen)。

Ⅲ-d. 亜硝酸イオングループとヘモグロビングループの差
亜硝酸イオングループとヘモグロビングループを比較すると、亜硝酸イオングループはヘモグロビングループの主張を否定することにも精力を費やしている印象を受けます。例えば、Gladwinの論文(Ref 1)には「低分子物質であるsニトロソサイオールの濃度は検出不能で、s-ニトロソアルブミンレベルも従来の報告より2桁低かった」とか「SNOHb は、上腕動脈の全血で170 nM であったが、動静脈血較差はなくNO産生は微量であった」という記述があり、実際に測定もしているようです。
一方、ヘモグロビングループは亜硝酸イオンに考慮を払っていません。その一方で、研究の範囲を病態に広げ、冠状動脈・糖尿病・肺高血圧症・輸血などで、自らも研究し賛同者も出現しています。
こうした態度の差が、研究の性質に基づくのか、研究者の資質の差に基づくのか、現在の動向や将来への見通しと関係するのかは不明です。

Ⅲ-e.「どちらとも言えない」、「双方、頭を冷やせ」という提言
亜硝酸イオン重視グループとヘモグロビン重視グループとの間には、考え方の上で大きなギャップがあり、第三者の解釈を困難にしています。それに対して一部の研究者は自ら戸惑いながら、双方の主張の問題点を指摘しさらに調停役も買って出ています(Ref 7, Robinson)。
まず指摘しているのは、いずれの物質も量の分析が不十分で生成率と消費率を量的に正確な評価が必要としています。その意味で、亜硝酸イオンもSNOHbも真の役割は現時点では不明で、唱えられているような作用はなくて実は単に「存在」するだけの可能性も否定できません。そもそも、ハイポキシアではNOの寿命が永い分だけ作用も強いことはすでに知られており、そうした効果との量的比較が必要でしょう。
一方、ヘモグロビンを介するハイポキシア誘導性血管拡張作用に必要なハイポキシアは、程度が強すぎるとの意見もあります。実験成績のSNOHbではPto2が 7.15mmHg、亜硝酸イオンでもこれより少し高い程度で、一般の組織のPto2 より低すぎると指摘します。しかし、代謝の活発な組織では、Pto2 は上記の7 mmHgは起こり得るレベルで、それだけで否定する根拠にもなりません。
暫定的な結論として、「ハイポキシアによる血管拡張に赤血球が関与しているという説は、SNOHb説も亜硝酸イオン説も、正常の代謝レベルの血管では確立していない。炎症など酸素消費率の高い組織では重要な役割を果している可能性はある」と述べています。

Ⅳ. 疾患との関係
NOが血液で運搬される関係で、いくつかの疾患や病態に注目しています。冠状動脈・糖尿病・肺高血圧症・輸血などです。
Ⅳ-a. 冠状動脈疾患:ニトログリセリンの冠状動脈に対する作用がNOを放出するのは確立した事実ですが、それにヘモグロビンが役割を果すかを検討した研究があります。
冠状動脈血流に制約のあるイヌを作成して各種パラメーターをみると、ニトログリセリン投与で、虚血血管床の中枢部位で冠状動脈血流が増加するのは当然として、血液粘性が20%低下し、赤血球荷電が低下し赤血球活動性が増加しました。インビトロでニトログリセリンに赤血球を加えると、赤血球のs-ニトロサイオールとSNOHbが増加しました。こうした実験結果より、ニトログリセリンの心筋虚血改善は、血管拡張と血流増加に加えて赤血球に作用してレオロジー改善作用と酸素放出促進用も寄与している、と結論しています。この研究は、Stamler とは独立のグループのようです(Ref 8, Bin)。
Ⅳ-b. 糖尿病:糖尿病の血管異常をヘモグロビン側から検討した研究があります。糖レベルの高いヘモグロビンは、NOとの親和性が増してNOレベルが高くなります。結果的にNOを放出しにくく、赤血球の血管拡張作用が障害され、糖尿病の細血管からみるとNOが得にくい状態になると解釈します。この研究もStamler とは独立のイギリスのグループです(Ref 9 James)。
Ⅳ-c. 肺高血圧症:各種病態での肺高血圧症患者と動物実験を組み合わせた報告です。まず静脈血[pO2 40 mmHg] を採血後すぐ空気に曝して、Hb[FeNO] からSNOHb(s-ニトロソヘモグロビン)に転換することを確認し、「肺で混合静脈血が酸素を受け取ると、すぐにSNOHbができる状況を再現していると解釈」しています。SNOHbは、静脈血に空気を吹き込んだ状態では70%もありますが、弱いハイポキシアに30分放置すると数%に激減します。「NOを放出した」とする根拠です。正常赤血球をハイポキシアに暴露すると、ヘム鉄ニトロシル (FeNO)ができ、NOをシステインのサイオール( -SH基)に移動できず、血管拡張作用のあるSNOHbが生成されません。s-ニトロソサイオールのない赤血球は、インビトロ実験では血管拡張作用がありません。これを動物に与えると、肺血管が収縮して肺の酸素化が障害されました。肺高血圧症患者の赤血球はFeNO/SNOHb の比が異常に高く、Po2 による血管径コントロールが不良です。動物と患者で、SNOHb量を化学的に増加させると赤血球の血管拡張能が回復し、血液酸素化が改善して肺動脈圧が低下します。しかし残念ながら効果は数時間に留まり、本格的な治療としては使えません。これはStamler グループの発表です(Ref 10 McMahon)。
Ⅳ-d. 輸血:血液の分析とその血液をイヌに投与して冠状動脈血流を測定しています。保存血の採血直後はアシドーシスとPco2 が上昇して、双方のボーア効果でPo2は逆に上昇します。血漿カリウム上昇・ナトリウム低下・乳酸上昇・グルコース濃度の極端な上昇なども通常通りです。一方、採血後に保存血のSNOHb量は急速に低下しました。イヌの冠状動脈血流測定では、ノルモシキア(FIo2 0.21)でSNOHb が10-20%と乏しい血液を輸血しても血流は不変ですが、SNOHbを回復させた血液の輸血では血流が増加しました。さらに動物をハイポキシア(FIo2 0.05)にすると冠状動脈血流は増加しますが、特にSNOHbを回復させた血液の輸血では大幅に増加しました。
結論として、血液のNOは保存で失われハイポキシアの血管拡張能も障害されますが、SNOHbを増せば輸血の効果が大きいとしています(Ref 11, Reynolds)。やはりStamler グループの発表です。
Ⅳ-e. 呼吸器とNOの問題:本稿では「ヘモグロビンとNO」がテーマですが、「呼吸器とNO」の論文もみつかったので、少しだけ加えます。Stamler のグループがAJRCCM誌に発表したもので、内容は、(1) アミノ酸・ペプタイド・たんぱく質などのSNO(ニトロソサイオール)が、呼吸器系でNO依存性の信号を発している証拠と、(2) このSNOが発する信号の呼吸器系での研究の進行を扱い、SNOが発する信号としては、換気のコントロールと換気血流比の調節、肺動脈圧調節、気道の緊張度調節、呼吸筋機能の調節などが考えられ、この調節の破綻は、各種呼吸器疾患たとえば無呼吸やハイポキセミアも関係すると結論しています(Ref 12,Gaston)。これは解説記事ですが、原著論文も少しあります。
なお、本稿ではもっぱら外国の研究者の発表を扱いましたが、インターネットには日本の研究者の発表もみつかり、特に大和田智彦氏の詳細な記事が入手できることを付言します(Ref 13,大和田)。

おわりに:今後の課題
NOは局所で産生されるだけでなくて、血液が運搬して必要部位に補給するとの主張、さらに候補とされる亜硝酸イオンとSNOHb(s-ニトロソヘモグロビン)が積極的に血管拡張作用を招いてハイポキシアの酸素運搬改善をコントロールしているという研究テーマを概観しました。
この研究が、今後実って科学的真実となるのか「科学史のエピソードに終る」のかは現時点では不明で、今後を見極めましょう。

参考文献:11以外は完全なオープンアクセスで、11も大部分を登録なしで読めるので、URL は書きません。13はインターネットのみの発表のようです。
1. Gladwin MT, Shelhamer JH, Schechter AN, Pease-Fye ME, Waclawiw MA, Panza JA, Ognibene FP, Cannon RO 3rd. Role of circulating nitrite and S-nitrosohemoglobin in the regulation of regional blood flow in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 10;97(21):11482-7.
2. Cannon RO 3rd, Schechter AN, Panza JA, Ognibene FP, Pease-Fye ME, Waclawiw MA, Shelhamer JH, Gladwin MT. Effects of inhaled nitric oxide on regional blood flow are consistent with intravascular nitric oxide delivery. J Clin Invest. 2001 Jul;108(2):279-87.
3. Crawford JH, Isbell TS, Huang Z, Shiva S, Chacko BK, Schechter AN, Darley-Usmar VM, Kerby JD, Lang JD Jr, Kraus D, Ho C, Gladwin MT, Patel RP. Hypoxia, red blood cells, and nitrite regulate NO-dependent hypoxic vasodilation. Blood. 2006 Jan 15;107(2):566-74.
4. Angelo M, Singel DJ, Stamler JS. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 30;103(22):8366-71.
5. McMahon TJ, Exton Stone A, Bonaventura J, Singel DJ, Solomon Stamler J. Functional coupling of oxygen binding and vasoactivity in S-nitrosohemoglobin. J Biol Chem. 2000 Jun 2;275(22):16738-4
6. Allen BW, Piantadosi CA. How do red blood cells cause hypoxic vasodilation? The SNO-hemoglobin paradigm. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006 Oct;291(4):H1507-12.
7. Robinson JM, Lancaster JR Jr. Hemoglobin-mediated, hypoxia-induced vasodilation via nitric oxide: mechanism(s) and physiologic versus pathophysiologic relevance. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005 Apr;32(4):257-61.
8. Bin JP, Doctor A, Lindner J, Hendersen EM, Le DE, Leong-Poi H, Fisher NG, Christiansen J, Kaul S. Effects of nitroglycerin on erythrocyte rheology and oxygen unloading: novel role of S-nitrosohemoglobin in relieving myocardial ischemia. Circulation. 2006 May 30;113(21):2502-8.
9. James PE, Lang D, Tufnell-Barret T, Milsom AB, Frenneaux MP. Vasorelaxation by red blood cells and impairment in diabetes: reduced nitric oxide and oxygen delivery by glycated hemoglobin. Circ Res. 2004 Apr 16;94(7):976-83.
10. McMahon TJ, Ahearn GS, Moya MP, Gow AJ, Huang YC, Luchsinger BP, Nudelman R, Yan Y, Krichman AD, Bashore TM, Califf RM, Singel DJ, Piantadosi CA, Tapson VF, Stamler JS. A nitric oxide processing defect of red blood cells created by hypoxia: deficiency of S-nitrosohemoglobin in pulmonary hypertension. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Oct 11;102(41):14801-6.
11. Reynolds JD, Ahearn GS, Angelo M, Zhang J, Cobb F, Stamler JS. S-nitrosohemoglobin deficiency: A mechanism for loss of physiological activity in banked blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(43):17058-62.
12. Gaston B, Singel D, Doctor A, Stamler JS. S-nitrosothiol signaling in respiratory biology. Am J Respir Crit Care Med. 2006 Jun 1;173(11):1186-93.
13. 大和田 智彦. 一酸化窒素(NO)の未知機能研究のための制御されたNOドナーの分子設計 http://www.dojindo.co.jp/letterj/108/reviews_01_main.html


[諏訪邦夫]